【科學世界】2015年諾獎解讀:抗瘧青蒿素—祝賀青蒿素發現工作獲得諾貝爾獎

   記者/孫天任 

     缘起

   此前,諾貝爾獎已經4次頒發給了瘧疾相關研究,足見學術界對它的重視。1884年,阿方斯?拉韋朗(Alphonse Laveran)確認瘧疾是由原生動物瘧原蟲引起的,而非之前認爲的細菌,1907年獲獎。1897年,英國人羅納德?羅斯(RonaldRoss)確認蚊子是傳播瘧疾的元凶,1902年獲獎。1939年,瑞士人保羅?穆勒(Paul Miller)發現DDT具有強大的消滅昆蟲的效果,可用以殺滅蚊子預防瘧疾,1948年獲獎。而最有意思的是1927年生理學或醫學獎獲得者、奧地利人朱利葉斯?瓦格納-堯雷格(Julius Wagner-Jauregg),他並非因治療瘧疾知名,而是用瘧疾治病得獎,他使用間日瘧原蟲引起的長期高燒治療神經性梅毒導致的麻痹性癡呆,取得了很好的療效,而瘧疾當時可以用奎甯治療,因此這種治療是可以被接受的。 

  自有人類以來,瘧疾就如影隨形。四種能夠感染人的瘧原蟲—間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲在上萬年間,與人類展開了針鋒相對的生存競爭,甚至人類的基因都爲之變異。在西非和中非,人們演化出了Duffy血型,使得紅細胞表面的Duffy抗原缺失,阻斷了間日瘧進入紅細胞的通道。而針對危害性最大的惡性瘧,非洲人還演化出了鐮狀細胞貧血,這是β珠蛋白基因單一堿基突變導致的性狀,可將惡性瘧的死亡率降低90%。但殺敵一千,自損八百,遺傳了鐮狀細胞貧血基因純合子的嬰兒將很難活到成年。此外,珠蛋白生成障礙性貧血(地中海貧血),葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏症(蠶豆病)等多種遺傳疾病,均屬于此類代價巨大的抗瘧方式。  

  人類與瘧疾的殘酷鬥爭不但镌刻在基因裏,也記載在文字中。古人避如蛇蠍的南方瘴氣,其實就是肆虐的瘧疾。中醫所載成百上千的治瘧方法,也反映了古代人對瘧疾的抗爭與無奈。直到1820年,人們才從南美洲土人治療瘧疾的金雞納樹樹皮中提煉出了有效成分奎甯。以後又發明了氯喹等藥物,但瘧原蟲並沒有束手待斃,隨之演化出了抗藥性。直到今天,瘧疾仍然是人類的最大威脅之一,每年殺死超過60萬人,有2億人因 爲患病而常常連續數日臥床不起。 

  奎甯及其類似物如氯喹等曾經救過無數人的生命。但在20世紀60年代的東南亞地區,瘧原蟲對這些藥物的抗藥性已經十分嚴重。此時,美國-越南戰爭正在印度支那半島激烈展開,戰爭雙方均面臨著瘧疾的嚴重威脅,尋找新的抗瘧藥物成爲當務之急。爲此,越南方面向中國提出了協助解決瘧疾困擾的要求,中國領導人接受了這一要求,在他們的指示下,國家科委和解放軍總後勤部于1967523日召開了“瘧疾防治藥物研究工作協作會議”,由此確立了由全國多部門參加的、以瘧疾防治藥物研究爲主要目標的任務。由于軍事保密需要,這一軍工項目遂以523日開會日期爲代號,稱爲“523任務”。 

  發現 

  按專業任務,523任務初始成立了化學合成藥、中醫中藥、驅避劑、現場防治4個專業協作組。其中與抗瘧藥物相關的是篩選已有化合物和合成新化合物的化學合成藥組,以及從中醫藥方面篩選天然化合物的中醫中藥組。 

  1969年,國家衛生部中醫研究院中藥研究所(以下簡稱北京中藥所)參加523任務,屠呦呦擔任組長,組員爲余亞綱,他們兩人 都畢業于北京醫學院藥物系,接受了現代科學研究方法的訓練,並在中醫研究院西醫學習中醫研究班中學習了本草學的發展曆史。其後倪慕雲、鍾裕蓉等相繼加入。同年4月,中醫研究院革委會業務組編寫了含有640余方的《瘧疾單秘驗方集》,屠呦呦等人從中篩選出了對鼠瘧效果較好的胡椒 提取物參加海南現場試驗,但臨床結果並不好。回到北京後,余亞綱再次查閱中醫藥文獻,摘出了800余條方劑,提出“重點篩選藥爲烏梅、烏頭、鼈甲、青蒿※等”。他認爲這幾種藥物在方劑中既有作單方使用,又在複方中頻繁出現,值得反複篩選。其中青蒿在 當時已被高郵等地區民間用作抗瘧藥物。在軍事醫學科學院進行鼠瘧篩選中,青蒿的乙醇提取物曾出現約70%左右的抑制率,僅次于雄黃,但不穩定。此後,余亞綱調離項目組,轉而參與老年慢性支氣管炎研究。 

  1971年下半年,屠呦呦複篩在過去試驗中表現出較高效價的中藥,但青蒿95%乙醇提取物的鼠瘧抑制率僅爲40%。屠呦呦重新 汲取東晉葛洪《肘後備急方》中青蒿截瘧的經驗,從“青蒿一握,以水一升漬,絞取汁,盡服之”中領悟到,青蒿抗瘧的有效物質可能在親脂組分中、且忌高溫。于是改用乙醚低溫提取,效價顯著提 高,鼠瘧抑制率達99%100%,但毒性較大。而後去除提取物中的酸性組分,保留了中性組分。經反複實驗,終于在1971104日獲得的191號的青蒿中性提取物樣品中,展現出了對鼠瘧100%的抑 制率。19723月,屠呦呦于南京在523中草藥專業會議上報告了這一成果,得到了廣泛關注。 

  現在分析起來,使用酒精提取青蒿時,將水溶組分和油溶組分一並提取了出來,因此其中的有效物質青蒿素的含量比較低,效果不佳。而現在知道,青蒿素結晶即使加熱到熔點157℃也不會分解,但在酒精溶液中,尤其在高溫下,青蒿素可能與溶液中微量的亞鐵離子發生反應,失去活性。因此在低溫下用親脂溶劑提取是可取的。低溫提取在植物化學中是常規方法,但是用乙醚提取卻是很少見。在化學實驗室的人盡量不用乙醚,因爲其沸點僅34.6℃,很難回收,而且易燃易爆,是危險品。更不用說在工廠大規模使用了。但在屠呦呦對青蒿素的實驗中,用乙醚提取卻闖出了一片新天地。   

  驗證 

  1972810月,屠呦呦等赴海南進行了中性提取物“醚中幹”的20余例臨床試驗,取得了很好的效果。此時,在北京的組員對中性提取物進行了進一步的純化,118日,鍾裕蓉由氧化鋁柱層析改用矽膠柱層析,分得了三種結晶,並通過鼠瘧篩選證實其中結晶II是唯一有效的單體,並命名爲“青蒿素II”。在1973910月使用青蒿素II進行的臨床床試驗中,對間日瘧有效,但未證實對惡性瘧的效果。 

  受到北京中药所青蒿素中性提取物的启示,云南省药物研究所的罗泽渊在云南大学校园内發現很多苦蒿,便特意采集了一些带回研究所,并于19734月用乙醚提取物分離直接得到有效結晶單體。經中科院昆明植物研究所吳征镒鑒定,這種苦蒿是黃花蒿的變型,即大頭黃花蒿,于是將這一結晶稱爲“黃蒿素”。同年6月,由于当地资源少,云南省药物研究所又从四川省酉阳地区(今重庆酉阳)购来了一批黄花蒿,發現其中黄蒿素的含量比云南的大头黄花蒿高出了10倍。他们發現的优质黄花蒿和后来改进的“溶剂汽油法”提取工艺,为青蒿素的大规模生产奠定了基础。 

  197311月,山東中醫藥研究所魏振興等也提取出了有效單體,並命名爲“黃花蒿素”。雲南和山東提取的有效單體在臨床上應用良好,並最終確認和北京中藥所的青蒿素II是同一種物質,統一命名爲“青蒿素”。現在已經知道,各地青蒿藥材中的青蒿素含量大不相同,北方和長江下遊地區以及國外的青蒿中青蒿素含量很低,只有雲貴四川一帶的青蒿中青蒿素含量較高。並且青蒿素在青蒿開花前含量最高,開花後就迅速降低,這可能就是此前篩選中抗瘧效果忽高忽低的原因。 

  隨著廣州中醫學院李國橋等人大規模臨床試驗的順利開展,青蒿素治療瘧疾大獲成功。確定化學結構的工作也隨之展開。北京醫學院林啓壽初步判斷屠呦呦提供的樣品是萜類化合物。1973年年底,屠呦呦來到中科院上海有機化學研究所(以下簡稱有機所),計劃請萜類專家劉鑄晉進行分析,但此時劉鑄晉改行研究液晶,所以沒有接受這項任務,而由植化專家陳毓群接待。1974年春節過後,陳毓群被下放到五七幹校,于是又安排給了當時避孕藥組的負責人陶正娥,由組內甾體植化專家吳照華接受了任務。當時很多研究都停止了,基礎研究大多靠邊站,只有523這樣的軍工任務與避孕藥這樣的國家任務能夠正常進行。 

  此時,北京中藥所倪慕雲等來到有機所共同開展工作,對樣品重新進行了純化重結晶,隨之進行了碳氫分析,核磁共振氫譜和碳譜,以及質譜等測試,同時也開展了一系列青蒿素化學反應的研究,以此推測青蒿素的結構。當時現代化的儀器很少,所幸是軍工項目,能夠使用全國僅有的幾台高級儀器。並由此很快得出了分子式C15H22O5,分子量282.34,不含氮。而當時已有的抗瘧藥都是像奎甯一樣的芳香雜環類化合物,分子中都含氮原子。青蒿素分子式的另一個特點就是氧原子多,在15個碳原子的分子中竟含有5個氧原子,那麽,這5個氧原子在分子結構中該怎麽安排,有沒有可能是過氧化物?有機化學中的一個常識是過氧化物容易爆炸,但青蒿素卻是相對穩定的一個分子,當時便因此否定了。 

  19754月,中國醫學科學院藥物所的于德泉在523項目組報告,提取到抗瘧活性很好的鷹爪甲素,分離出有效單體並探明了結構,這是一種倍半萜過氧化物,而且也比較穩定。不過鷹爪甲素的提取非常困難,此後這一工作未推進下去。但這一報告提示了青蒿素也有過氧結構的可能性。有機所的吳毓林在獲知消息後,立刻做了一個最簡單的定性實驗,加入碘化鉀後,青蒿素溶液變黃了,這是由于其中的碘離子被過氧化物氧化成了碘,說明青蒿素中果然含有過氧基團,此後吳照華通過定量分析實驗確認了青蒿素和鷹爪甲素一樣是倍半萜過氧化物。 

  除了過氧基團外,吳照華確定了青蒿素另外一個重要基團是內酯基團,有機所還進一步確證了青蒿素的內酯基團可爲鈉硼氫還原爲雙氫青蒿素,而分子中的過氧基團則不受影響,還原産率可高于90%,內酯還原後生成內半縮醛,露出一個羟基,由此爲以後青蒿素衍生物的制備奠定了基礎。 

  當時,有機所的技術和儀器還是不完備,只能推斷出初步結構。屠呦呦等同時商請中科院生物物理研究所合作,通過X射線衍射法測定結構。7511月,吳照華和吳毓林把他們與北京中藥所倪慕雲及此後參與工作的劉靜明、樊菊芬一起得到的初步結果告知了生物物理所,到了年底,生物物理所李鵬飛等便得到了准確的青蒿素分子結構。但當時的X射線衍射法不能區分鏡像結果,此後又使用了反常散射的X射線衍射法,最終確定了絕對構型。  

  成藥 

  驗證了青蒿素的药效、判明了青蒿素的结构之后,为克服青蒿素的溶解度差、复发率高等缺点,结构改造工作便提上了日程。1976年,這一任務由523办公室交给了中科院上海药物研究所(以下简称药物所)。在实验中,药物所發現过氧基还原后的脱氧青蒿素无效;而内酯基加氢还原得到的双氢青蒿素效价比青蒿素还要高。但双氢青蒿素的稳定性较差、溶解度也没有多大改善,于是集中力量开发双氢青蒿素的衍生物,药物所李英等合成了双氢青蒿素的醚类、羧酸脂类和碳酸酯类衍生物,發現效价几乎都高于青蒿素,其中双氢青蒿素和甲醇经醚化反应生成的蒿甲醚效价是青蒿素的6倍,而且油溶性很大,被列爲重點研究對象。1981年,蒿甲醚注射液就上臨床應用了。 

  1977年的523會議上,桂林制藥廠劉旭聽說了藥物所的進展,立刻著手進行青蒿素衍生物的開發,並成功合成了雙氫青蒿素的琥珀酸半酯,即後來的青蒿琥酯,它的鈉鹽水溶性較好,可用于靜脈注射,且效價比青蒿素高。在解決制劑問題後,也很快在臨床使用了。 

  在“文革”结束后,青蒿素类抗疟药的相关論文相继发表,并主动公开了青蒿素的化学结构,因当时中国没有專利制度,所以也不存在申请專利的问题。青蒿素类抗疟药的疗效迅速引起了世界卫生组织(WHO)的注意,我国也希望能将中国创制的这一系列新藥向外出口。在与WHO的較長時間合作中,了解到在藥物研制時需要參照藥品非臨床研究質量管理規範(good  laboratory practice of drugGLP)、藥物臨床試 驗質量管理規範(good clinical practiceGCP)等国际规范,促进中国建立了《新藥审批办法》。青蒿素及其衍生物作为示范,补充完成了三致试验(致癌性、致突变和致畸胎性试验)等毒性试验和按照GCP規範進行的I期和II期临床试验。这样,青蒿素栓、青蒿琥酯注射剂、蒿甲醚注射剂成为《新藥审批办法》实施后的前三种新藥。到1995年,全国共批准一类新藥14個,其中青蒿素類抗瘧藥就占有5種。在工業生産上,制藥廠爭取與藥品生産質量管理規範(good manufacturing practicesGMP)接軌,先後建立起符合GMP的生産車間,走上了規範化道路,爲我國首創的青蒿素類抗瘧藥進入國際市場掃清了障礙。   

  尾  

  此後,以複方蒿甲醚片(蒿甲醚-本芴醇複方)爲代表的青蒿素類複方抗瘧藥(artemisinin  based  combination  therapy,ACT)相繼出世,並與蒿甲醚、青蒿琥酯共同進入WHO《基本藥物目錄》。複方蒿甲醚片在與諾華公司合作後,順利進入國際市場。但是在2004年前,95%罹患瘧疾的非洲兒童仍只能得到氯喹作爲抗瘧藥,而此時氯喹大多僅能起到退燒作用了。2004年以來,青蒿素類複方抗瘧藥逐步取代氯喹,成爲全球抗瘧的首選藥品。  

  纵观青蒿素从發現到成为全球一线抗疟药物的三十多年,正如屠呦呦所言:“获得诺贝尔奖是一个很大的荣誉,青蒿素衍生物研究成功是多年研究團隊集體攻關的成績,青蒿素獲獎是中國科學家集體的榮譽。是中國的驕傲,也是中國科學家的驕傲。”523項目內部公開透明的協作精神仍然值得今天的學術界學習。 

  值得欣喜的是,經過多年研究,青蒿素的一些衍生物表現出對 紅斑狼瘡、白血病等的動物療效,有關研究正在進行中。以過氧基團爲核心的青蒿素結構仍然有著很大的藥用潛力,希望相關研究能夠繼續輝煌,爲人類造福。 

  致谢:在本文成稿过程中,記者采访了中國科學院上海有機化學研究所、中國科學院上海药物所参与青蒿素工作的专家,并参考了《青蒿素类抗疟药》等專著和《青蒿素——历史和现实的启示》的等相关研究論文,在此表示感谢。