Nat. Chem. Biol. 背靠背 | 上海药物所揭示缩胆囊素受体识别配体和G蛋白选择性的分子机制

  北京时间2021年9月23号,中國科學院上海药物研究所蒋轶/徐華強团队、趙強团队、吳蓓麗团队、王明偉/杨德华团队和上海科技大學赵素文团队于Nature Chemical Biology背靠背在线发表了题目分别为 ”Ligand recognition and G protein-coupling promiscuity of cholecystokinin A receptor” 和“Structures of the human cholecystokinin receptors bound to agonists and antagonists”的两项研究成果,解析了2种小分子拮抗剂(Devazepide、Lintitript)和激动剂NN9056与A型人源缩胆囊素受体(Cholecystokinin receptor,CCKAR)結合的3個晶體結構,以及多肽激素CCK-8的CCKAR分別與3種不同G蛋白(Gs、Gi、Gq)偶聯複合物和多肽Gastrin-17分別與B型縮膽囊素受體(CCKBR)和兩種G蛋白(Gi、Gq)形成複合物的5個冷凍電鏡結構。兩項研究系統性地揭示了多種多肽和小分子配體特異性識別縮膽囊素受體亞型的結構基礎,闡明了配體選擇性和受體活化的分子機制,破解了CCKAR選擇性偶聯不同G蛋白的生命奧秘,從而爲靶向該類受體的藥物研發提供了重要信息。
  缩胆囊素(Cholecystokinin, CCK)是早在1968年就被提取鉴定的胃肠激素之一。CCK和胃泌素(Gastrin)是酪氨酰磺酸化多肽家族成员,具有保守的羧基末端八肽序列。两者在胃肠道和中枢神经系统中含量丰富,通过与缩胆囊素受体结合发挥激素调节和神经递质的作用。缩胆囊素受体包括A和B两个亚型(CCKAR和CCKBR),屬于A類G蛋白偶聯受體(GPCR)。CCKAR特異性識別磺酸化的CCK,而CCKBR對磺酸化和非磺酸化的CCK和Gastrin均具有較強的親和力。這兩類CCK受體參與調控的生理功能包括飽腹感、胰酶分泌和膽囊收縮,同時也與焦慮、記憶和藥物成瘾等相關,因而是肥胖症、2型糖尿病和焦慮症等疾病的潛在治療靶標。高選擇性CCKAR非肽类拮抗剂(如Devazepide和Lintitript)被开发用来治疗胃肠功能紊乱、神经性疼痛和胰腺癌等疾病,而其激动剂NN9056对肥胖症具有一定疗效。但由于低药效和生物利用度等问题,大多数靶向CCKR的候选药物终止于临床研究。因此,开展CCKR的结构与功能研究将深化对其配体识别机制的认识,助力相关新藥的创制。
  GPCR被配體激活後主要通過偶聯細胞內的G蛋白進行信號轉導。根據α亞基的不同,G蛋白可分爲Gi/o、Gs、Gq/11和G12/13等四亞家族。雖然目前已經報道了不同GPCR與其下遊G蛋白結合的大量複合物結構,但受體如何精確識別這四種G蛋白一直困擾著科研人員。由于CCKAR能夠偶聯這四種不同的G蛋白,因而成爲研究GPCR與G蛋白選擇性結合機制的模式受體。
  在第一项研究中,蒋轶/徐華強/王明偉/杨德华联合团队解析了磺酸化CCK-8激活的CCKAR與Gq、Gs和Gi蛋白偶联的复合物冷冻电镜结构,分辨率分别为2.9 埃、3.1 埃和3.2 埃(图1a)。结合结构分析和功能验证,该工作展示了内源多肽激素—磺酸化CCK-8(以下简称CCK-8)的结合模式:CCK-8的氨基末端由受体的三个胞外环(ECL)紧紧包裹,其羧基末端插入受体的正构口袋。他们还鉴定了识别CCK-8的关键氨基酸残基和磺酸化基团发挥CCK-8活性的关键位点:位于CCKAR上ECL2區域的R197與CCK-8第二位酪氨酸修飾的磺酸基通過鹽鍵結合進而決定磺酸化多肽的高親和力(圖1b)。
  此外,該研究也對CCKAR選擇性偶聯Gq、Gs和Gi的分子機理進行了闡述,並提出了ICL3參與CCKAR與Gq偶聯的新機制。科研人員發現,偶聯三種不同G蛋白的受體呈現相似的激活構象,然而受體與不同G蛋白結合界面的面積顯示Gq > Gs > Gi的趨勢。與之一致,CCKAR與其主要下遊信號蛋白Gq偶聯時産生的最大的激活效應(Emax)顯著高于Gs和Gi。這些結果支持Gq是CCKAR主要偶聯的G蛋白類型,明確了接觸面積在G蛋白選擇性識別中的作用。這項工作進一步證實了Gq、Gs和Gi蛋白α亚基α5螺旋的末端弯钩(Wavy hook)是CCKAR對G蛋白選擇性的參與者(圖1c)。在CCKAR與Gq的複合物中,他們還發現CCKAR胞內環ICL3的I296與Gαq亞基的一個疏水結合口袋結合,這也是首次在GPCR結構中觀測到ICL3與Gα亞基的相互作用方式(圖1d)。相反,由于Gαs和Gαi與Gαq在該疏水口袋殘基組成的差異,CCKAR的相應ICL3區域與Gs和Gi不存在該疏水作用,說明ICL3決定了G蛋白之選擇性。
图1. 内源多肽CCK-8活化的CCKAR与和不同G蛋白偶联的冷冻电镜结构。
  在第二项研究中,趙強/吳蓓麗/王明偉/杨德华/赵素文联合团队解析了CCKAR與小分子拮抗劑Devazepide、Lintitript和激動劑NN9056結合的三個晶體結構,以及結合多肽Gastrin的CCKBR分別與Gi和Gq偶聯的兩個複合物冷凍電鏡結構(圖2a-e)。該工作揭示了多肽和小分子拮抗劑識別CCKR的分子機制,發現了ECL2是CCKAR和CCKBR選擇性識別多肽配體的決定因素。ECL2上的H207與多肽中D2形成的氫鍵決定了CCKBR對CCK-8、CCK-8ns和Gastrin-17的高親和力(圖2f),而ECL2上的R197與多肽中Y7的磺酸基形成的鹽鍵決定了CCK-8對CCKAR的高選擇性(圖2g)。同時,科研人員還發現N3336.55和R3366.58在CCKAR識別Devazepide和Lintitript過程中發揮了關鍵作用,爲後繼選擇性靶向藥物的開發奠定了基礎。
  此外,科研人員通過比對CCKAR結合拮抗劑Devazepide的結構、CCKAR結合激動劑NN9056的結構以及CCKAR同時結合激動劑CCK-8ns和Gq蛋白的結構,結合分子動力學模擬實驗,闡釋了CCKAR逐步激活的過程。相對于拮抗劑,激動劑在結合口袋中結合更深(圖2h),隨後引起PIF和FxxCWxP保守基序的變化(圖2i和2j),進而導致受體胞內部分發生TM6和TM5向外以及TM7向內移動的激活態構象變化,從而揭示了CCKAR逐步激活的分子機制。
 
图2. CCKR分别与小分子拮抗剂和多肽激动剂结合的三维结构。
  第一项研究由上海药物所蒋轶/徐華強研究团队领衔,联合王明偉/杨德华团队,并在英国剑桥大学Tristan I. Croll的帮助下完成。上海药物所博士后刘秋枫、研究员杨德华和特别研究助理庄友文为共同第一作者。第二项研究由上海药物所趙強/吳蓓麗领衔,联合王明偉/杨德华团队和上海科技大學赵素文团队,并在丹麦诺和诺德公司Ulrich Sensfuss和Steffen Reedtz-Runge等的帮助下完成。上海药物所博士研究生张雪锋、複旦大學藥學院博士研究生何承霖、上海药物所博士研究生王沐、複旦大學基础医学院青年研究员周庆同、上海药物所研究员杨德华和博士后朱亚为本文共同第一作者。上海药物所为两篇論文的第一完成单位,冷冻电镜数据在上海药物所冷冻电镜中心收集。该工作获得了国家科技部重点研发计划、国家卫健委科技重大专项、国家自然科学基金委、中國科學院先导项目和上海市科技重大专项等经费的资助。
  文章鏈接:
  第一篇:https://www.nature.com/articles/s41589-021-00841-3
  第二篇:https://www.nature.com/articles/s41589-021-00866-8

   (供稿部门:徐華強课题组、趙強课题组、王明偉课题组)